سنتز پرایمر، سنتز پروب، سنتز پپتید
طراحی پرایمر و پروب
خدمات طراحی پرایمر و پروب را شرکت ژن آزما تجهیز با استفاده از قدرتمندترین نرم‌افزارهای بیوانفورماتیک در راستای پاسخگویی به نیاز پروژه تحقیقاتی شما ارائه می‌دهد.
ابتدا در واکنش زنجیره‌ای پلیمرا (DNA ، (PCR به دو رشته جدا از هم تبدیل می‌گردد. در مرحله دوم پرایمرها به مناطق مکمل مولکول‌های تک‌رشته‌ای متصل می‌شوند. در مرحله سوم، آنزیم DNA پلیمراز باعث گسترش رشته‌های DNA می‌شوند. تمام این مراحل طی بک سیکل دمایی مشخص و در زمان معین انجام می‌شوند.
طراحی پرایمر مناسب برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR) موفقیت‌آمیز امری ضروری و حیاتی است. در طراحی پرایمر باید به نکات زیر توجه نمود:
1) طول اولیه پرایمر
طول بهینه پرایمرها برای انجام PCR بین 18 تا 24 جفت باز است تا پرایمرها به‌راحتی به رشته الگ. در دمای انلینگ بچسبند.
2) دما ذوب اولیه (Tm)
دمایی است که در آن نیمی از دوپلکس DNA برای تبدیل‌شدن به تک رشته جدا می‌شود و نشان‌دهنده استحکام در رشته‌های DNA است. پرایمرها با دمای ذوب در محدوده 50-60 درجه سانتی‌گراد عموماً بهترین نتایج را نشان می‌دهند. آغازگرهای با دمای ذوب بالاتر از 65 درجه سانتی‌گراد تمایل به ساختار ثانویه دارند و معمولاً باعث اتصالات غیراختصاصی می‌گردد.
3) درجه حرارت اولیه
درجه حرارت ذوب اولیه یک برآورد پایداری ترکیبی DNA است و میزان دمایی است که دران دو رشته DNA از همدیگر جدا می‌شوند پس اگر بیش‌ازحد بالا باشد عمل هیبریداسیون پرایمر به‌صورت نامناسب انجام می‌گیرد و منجر به تولید محصول PCR می‌شود که از کیفیت خوبی برخوردار نیست و منجر به تولید محصولات غیر خاصی می‌شود که ناشی از تعداد زیاد ناسازگاری‌های جفت‌پایه است.
4) محتویات GC
محتوای GC در پرایمر به‌عنوان یک درصد از کل پایه پرایمر باید بین 40-60% باشد.
5) گیره GC
حضور پایگاه‌های G و C در انتهای 3 ‘ پرایمر (گیره GC) مانند یک گیره به پرایمر کمک می‌کند تا اتصال قوی‌تری ایجاد کند و بستگی به پیوندهای سه‌گانه اسیدهای نوکلئیک می‌باشد.
6) ساختارهای دوم پرایمر
ساختارهای ثانویه پرایمر توسط اتصالات بین‌مولکولی یا داخل مولکولی ایجاد می‌شوند و می‌تواند منجر به تضعیف یا عدم عملکرد پرایمر شود. ازجمله ین ساختارها فرم Hairpins است که دران پرایمر به شکل سنجاق‌سر بر روی خود برمی‌گردد و باعث اتصال به خودش شده درنتیجه کارایی ندارد. Self-dimer primer نیز از موارد ساختاری نادرست در پرایمر است که دو پرایمر همولوگ به همدیگر اتصال پیدا می‌کنند. یکی دیگر زا مشکلات رایج اخطار Cross Dimer می‌باشد که به‌طورکلی مقادیر زیادی از پرایمر ها در PCR در مقایسه با مقدار ژن هدف مورداستفاده قرار می‌گیرند در این شرایط باندی در پایین‌ترین قسمت ژل دیده می‌شود. در این شرایط در چند باز که همولوگ هم هستند اتصال صورت می‌گیرد و باعث ایجاد این اشتباه می‌شود.
7) توالی‌های تکرار
گاهی تکرار دی نوکلئوتید چندین بار به‌صورت متوالی اتفاق می‌افتد و باید از آن اجتناب شود، زیرا ممکن است باعث اتصالات اشتباه و یا مواردی که اشاره شد گردد. به‌عنوان‌مثال در این توالی ATATATAT حداکثر تعداد تکرارهای دی نوکلئوتید در الگو قابل‌قبول 4 بار است ولی تا جایی که شرایط طراحی اجازه می‌دهد باید ازاین‌گونه توالی‌ها جلوگیری کرد. باید از رشته‌های طولانی از یک باز اجتناب شود. به‌عنوان‌مثال، در این توالی AGCGGGGGATGGGG باز G 4 و 5 بار پشت سرم تکرار شده است که حداکثر تعداد قابل‌قبول 4 بار است.
8) اجتناب از ساختار ثانویه الگو
الگوی تک رشته توالی‌های اسید نوکلئیک بسیار ناپایدار است و به ترکیبات (ساختارهای ثانویه) تقسیم می‌شود. ثبات این سازه‌های ثانویه الگو بستگی زیادی به انرژی آزاد و دمای ذوب آن‌ها (Tm) دارد. توجه به ساختارهای ثانویه الگو در طراحی پرایمرها به‌ویژه در qPCR مهم است. پس برای به دست آوردن نتیجه بهتر باید از قالب‌های پایدار در طراحی استفاده کرد. برای ایجاد قالب پایدار باید ابتدا یک DNA دو رشته ایجاد کرد و از توالی آن برای طراحی استفاده کرد و منظور از قالب پایدار همین است.
9) اجتناب از همولوژی
برای بهبود خاصیت پرایمرها لازم است از مناطق همخوانی جلوگیری شود. پرایمرهای طراحی‌شده نباید بر ژن‌های غیراختصاصی تأثیر داشته باشد. به‌طورمعمول، پرایمرها طراحی‌شده مورد BLAST قرار می‌گیرند که در صورت پیشنهاد دیتابیس بتوان از یک جایگزین بهتر استفاده کرد.
با توجه به نکات گفته‌شده باید به چند نکته در طراحی پرایمر و پروب دقت کرد:
- طول پرایمر باید 18-24 جفت باز باشد
- محتوای GC باید در رنج 40 تا 60 درصد باشد
- دمای ذوب یا TM بین 50-60 درجه سانتی‌گراد باشد
- بین دو رشته پرایمر دمای Tm باید 5 درجه سانتی‌گراد از یکدیگر تفاوت داشته باشد
- مناطق مکمل وجود نداشته باشد
طراحی پرایمر و پروب برای واکنش Real-Time PCR به‌دقت بیشتری نیاز دارد ولی کلیات در طراحی پرایمر ها چه برای واکنش‌های ساده PCR چه واکنش‌های Real-Time PCR یکسان است.
در طراحی پرایمر و پروب برای واکنش Real-Time PCR علاوه بر نکات قبلی باید به این نکات نیز توجه کرد:
- Tm برای پرایمر 58-60 درجه سانتی‌گراد و برای پروب 10 درجه بیشتر از Tm پرایمر باشد
- طول پرایمر 15-30 جفت باشد
- محتویات GC باید 30-80% باشد
- در توالی پرایمر و پروب داشتن حتی یک نوکلوتید مشابه مشکل‌ساز است
- ماکسیمم طول توالی بیشتر از 400 جفت باز نباشد. امپلیکون های کوچک‌تر نتایج پایدارتری می‌دهند
- پروب نباید تکرار نوکلوتید یکسان داشته باشد
- پرایمر را بر اساس نواحی اگزون در توالی cDNA طراحی شوند
طراحی با استفاده از نرم‌افزار
استفاده از نرم افزارها می‌تواند هزینه، زمان و احتمال خطا در طراحی پرایمر را کاهش داد. ولی باید به این نکته دقت کرد که یک نرم‌افزار به‌تنهایی قادر نخواهد بود که تمامی نکات لازم برای طراحی یک پرایمر خوب را ارائه دهد. شرکت ژن آزما تجهیز با استفاده از چندین نرم‌افزار قدرتمند کارآیی و کیفیت پرایمر طراحی‌شده را تضمین می‌نماید.
از نرم‌افزار مورداستفاده در طراحی پرایمر و پروب می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:
- Primer Premier نرم‌افزاری است که می‌تواند هم‌زمان فاکتورهای متعددی را مورد برسی قرار دهد.
- Primer3 نیز یک نرم‌افزار آنلاین در طراحی پرایمر است و از دقت بالایی برخوردار است.
- PrimerPlex نرم‌افزاری است که می‌تواند آغازگرها را برای Multiplex PCR و تست‌های ژنوتیپ SNP چندگانه طراحی کند.
- نرم‌افزارهایی مانند AlleleID و Beacon Designer در طراحی پرایمر متقاطع، طرح پرایمر متقابل گونه برای تست‌های تشخیص پیچیده کاربرد دارند
چرا شرکت ژن آزما تجهیز ؟
کیفیت
ما متعهد به ارائه خدمات با بالاترین کیفیت، اطمینان از بازتولید نتایج.
زمان تحویل
به‌طورمعمول کمتر از ۱۵ روز (بسته به تعداد و نوع نمونه‌ها).
قیمت‌گذاری
با تخصصی تیم فنی، ما را قادر می‌سازد که کمترین و رقابتی‌ترین قیمت را ارائه کنیم.
ارتباط نزدیک با مشتریان
ما با مشتریانمان برای اطمینان از بهینه‌سازی طرحشان ارتباط داشته و نتایج را با شما در میان میگذاریم.